Baker 团队最新研究，让 AI 设计的蛋白质接管基因开关

找到基因之后，谁来按下启动键？

基因表达像一项需要多人配合的生产任务：有人找到地址，有人整理现场，还有人召集转录机器。转录因子靠 DNA 结合结构域定位，再靠激活结构域招募共激活因子。但天然激活结构域往往结构松散，会以较弱的相互作用联系多个伙伴。

这样的分工能运转，但很难拆清每个伙伴的贡献。团队希望设计结构明确的结合蛋白，分别控制招募对象和结合强弱。先把招募接口做清楚，才可能看懂基因为什么被打开。设计蛋白也因此成为机制探针。

AI 先找接口，细胞再决定谁能上岗

第一步是寻找可用的接触面。研究者用 AlphaFold 3 分析 726 个激活结构域与 13 个共激活因子结构域的潜在相互作用，得到 981 个非冗余候选相互作用片段。但这些属于结构预测，不能直接当作已经发生的细胞内结合。

随后，团队沿着这些接口，用 RFdiffusion3 生成蛋白骨架，用 ProteinMPNN 设计序列，再由 AlphaFold 3 评估、迭代。最终约 4 万个计算筛选后的设计进入实验。但结构看起来贴合，只是第一关；真正的考题是能否启动转录。

为此，研究者把筛选搬进哺乳动物细胞。候选蛋白只有成功触发转录，才会启动分子记录机制，恢复抗药基因的读框，让细胞在筛选中存活。但这里记录的是功能，不能仅凭存活就认定每个候选的结合亲和力。

四轮混合筛选找到了 300 多个候选，随后挑出的 34 个结合蛋白全部通过报告基因激活验证。但这 34 个是经过挑选的命中设计，不能据此宣称 4 万个设计全部有效，也不能算成随机抽样的成功率。

它们是否真的招来了预定伙伴？团队敲除了共激活因子 MED25。原本有效的 MED25 结合蛋白随即失去可检测的激活能力，MED15 结合蛋白仍然有效。但这是针对 MED25 的遗传验证，不能直接外推到全部设计。

其他靶点的专一性分析更多依赖结构预测。在所测共激活因子面板内，模型支持设计蛋白优先识别预期靶点。但“预测偏好自己的靶点”与“在整个细胞里没有其他结合对象”，仍是两种不同强度的结论。

抓得更紧，为什么不再亮一点？

接下来，团队盯住 p300 的 KIX 结构域，像调节卡扣松紧一样，修改结合界面的接触。三个原始设计及其变体，共组成 36 个蛋白，亲和力横跨低纳摩尔到微摩尔范围。但把结合强弱排好队后，转录输出并没有跟着平滑变化。

在锌指定位的报告系统里，亲和力变弱到一定程度，激活才突然下坠。拟合转折点为 481 nM，Hill 系数为 5，拟合优度 R² 为 0.94。但这属于特定 KIX 变体与报告体系；481 nM 不是所有基因开关共用的门槛。

当 KD 从个位数纳摩尔变到数百纳摩尔，报告输出大体保持稳定；再继续减弱，输出才明显降低。但越过强结合一侧的激活区间后，继续追求更低的 KD，未必换来更多表达。设计目标因此不能只剩“抓得更紧”。

团队用表面等离子共振测结合，再用荧光报告测功能，让同一组界面变体连接起两类读数。结果支持协同招募的解释。但观察到的陡峭程度超过简单双位点模型的预期，招募之后还有哪些非线性步骤，尚未拆清。

“更多细胞打开”与“每个细胞更亮”，要分开算

接到 dCas9 后，这些设计还要面对染色体上的真实基因。在 HEK293T 细胞的 CD34 实验中，12 个 p300 结合蛋白有 11 个带来了比 VPR 更高的阳性细胞比例。但这是“有多少细胞被激活”，不等于每个阳性细胞表达更强。

多数设计的 CD34 表达强度仍低于 VPR，只有 TAZ2-binder-4 例外。但这个区别容易被一句“全面超越 VPR”抹掉。激活覆盖率、表达强度和表达均一性，必须分别比较。这篇论文的价值，也藏在这些没有同步变化的指标里。

换到不同基因位置，优势又发生变化。在测试的启动子上，设计蛋白总体与 VPR 相当或更弱；在测试的增强子上则更有优势。但增强子和启动子承担的调控任务不同，不能把其中一类结果写成所有位点上的统一排名。

报告基因里表现不错的 MED15、MED25 和 NCOA1 结合蛋白，在沉默的 CD34 位点却作用有限。p300 招募在这一场景中更有效，抑制其催化活性还会消除激活。但这些结果仍来自特定细胞和位点，工具能否迁移需要继续测试。

一个模块不够，就把分工重新组合

既然 p300 有自己的长处，能否再增加一类帮手？团队把 VP64 与 p300 结合蛋白分别接在 dCas9 两端，在 OCT4 启动子上得到更强激活。但这里的组合包含天然激活模块 VP64，不能描述成一套完全从头设计的调控机器。

图中三个组合相对各自的单独结合蛋白，增益分别为 2.8 倍、24 倍和 3.5 倍，并超过该实验中的 VPR。但这些倍率来自同一个测试场景。它提示的设计方向，是按分工组合招募模块，而非保证任意组合都能产生同样增益。

更小的模块，还要过更长的安全关

团队也检查了表达这些工具的细胞负担。五种结合蛋白融合构建体支持的病毒产量，约为 VPR 的 3—6 倍。但它们仍低于单独使用 dCas9 的对照；产量较高只能间接支持负担较小，不能等同于完整的毒理验证。

“对细胞更温和”目前应限定在这些实验条件与代理指标内。但递送后的长期表达、原代细胞表现、免疫反应和体内安全性，仍需要额外证据。模块从约 600 个氨基酸缩到几十个，尚不足以直接推出临床可用。

转录组结果也留了一根刺。部分 TAZ2 结合蛋白还上调 SNCG、S100A1 等非目标基因；设计蛋白的整体扰动略多于 VPR。但完整机制尚未确定，更强的激活能力也必须与额外扰动一起评估。

这项尚未同行评议的研究，推进了可编程基因激活，但基因抑制仍是后续设想。能把开关打开，只是第一关；能否在不同细胞中只打开想要的那一组，才是接下来的考题。