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首个！AI造出"自然界不存在"的RNA结构

蛋白质设计早已是 AI 的主场，RNA 却迟迟攻不下。这一次，Das 实验室和 Eterna 玩家联手，用一场 57 个假结的"人机大战"，把这道墙推倒了。

BioTender 编辑部 · 解读自 bioRxiv 预印本（2026.05.21）

论文标题与作者列表 — 论文《De novo design of RNA pseudoknots with deep learning》，作者横跨 Eterna、Stanford、UW、UCSD、Cambridge、Janelia 等机构，通讯作者 Rhiju Das。

蛋白质从头设计为什么能在 AlphaFold 之后一路狂奔？因为有了准到原子级的三维结构预测当"裁判"。

RNA 一直没这个裁判。三维结构预测对天然 RNA 都勉强，对人工合成序列更是几乎瞎猜——CASP15、CASP16 的成绩单都摆在那。所以行业里一个根深蒂固的共识是：RNA 从头设计，得先把 RNA 三维结构预测这块硬骨头啃下来。

Das 实验室这篇 5 月 21 日挂上 bioRxiv 的预印本，把这个前提直接掀了。

他们证明：不解决三维结构预测，照样能从头设计出复杂的 RNA 假结结构。AI 设计出来的分子，不仅二级结构准，折叠出来的三维构象还自带一堆"没人教过它"的非经典相互作用。

这是 RNA 设计领域第一次，真正意义上的 de novo——造出自然界里不存在的新结构，而不是给已知结构换个序列。

不解决三维结构预测，照样能从头设计出复杂的 RNA 假结。

壹先搞清楚：假结到底难在哪

二级结构里，碱基配对一般是"乖"的——一个茎（stem）里的核苷酸自己跟自己配。

假结（pseudoknot）不乖。它是茎环里的核苷酸，跑去跟环外面的核苷酸配对，在拓扑上打了个结。自然界里，假结是核酶、核糖开关、核糖体移码信号这些复杂功能的结构基础。

假结类型示意图 — 背景RNA 假结的几种典型拓扑：发夹型（H-type）、kissing loop 等。茎环中的核苷酸与环外核苷酸交叉配对，是假结复杂三维拓扑的来源。

难就难在：这种交叉配对让结构预测算法非常头疼，也让设计变得极不可控。过去能"设计"出来的新假结，基本只局限于 RNA 折纸（origami）那一类特殊分子，通用的三级模体拼装根本做不到。

评估设计是否成功，靠的是 SHAPE 化学探针——单链、柔性的核苷酸会被优先酰化、信号高，配对的核苷酸被保护、信号低。把每个核苷酸的反应性逐位读出，就能反推它的配对状态。

全长RNA的SHAPE反应性图谱 — 方法SHAPE 可在单核苷酸分辨率下读出整条 RNA 的结构信息——高反应性（红）对应柔性单链，低反应性（黑）对应稳定配对，进而映射出二级结构。

所以 Das 实验室把战场选在假结上，是故意挑了块最硬的地方下手。

贰一场打了四轮的人机擂台

这篇论文的核心，是 Eterna 平台上"OpenKnot"挑战赛的扩展版。规则很简单粗暴：给定一个目标二级结构，看谁能设计出真的会这么折叠的 RNA 序列。

参赛双方：一边是六种 AI 算法，另一边是 Eterna 上身经百战的人类玩家。裁判用 SHAPE 信号算出"OpenKnot 分数"（0 到 100），超过 90 分算成功。

论文正文：第一轮挑战描述 — 原文扩展版 OpenKnot 第一轮邀请六种 AI 方法提交设计接受 SHAPE 实验检验；17 个目标二级结构取自 11 个有 PDB 三维结构的天然 RNA，以及 6 个 Eterna 玩家提出的合成假结。

第一轮（17 个目标），AI 被人类按在地上摩擦。Rosetta、3DRNA、gRNAde、MPNN-RFdiff 这些方法，大多数连 90 分门槛都摸不到，集体跑输 Eterna 玩家。唯一的例外是 MPNN-fixbb——一个给定骨架来设计序列的消息传递网络，平均表现比天然起始序列要好。

Figure 1：W03目标上各方法的表现 — 图 1以 W03（c-di-GMP-II 核糖开关）为例的性能总览。（A-D）目标结构与各方设计的实测 SHAPE 谱；（E）大量序列的 SHAPE 反应性热图；（F）得分高的设计往往与天然序列差异极大（序列一致性 < 50%）；（G-J）第一轮到第二轮的整体性能跃升。

这里有个反直觉的细节：得分高的设计，序列往往跟天然序列差得很远（序列一致性 < 50%）；反过来，所有跟天然序列像 90% 以上的设计，统统拿不到 80 分。想让结构稳，反而得大胆离开自然给的答案。

转折点出现在第一轮结束后。研究者发现一个叫 RNet 的神经网络——它在 100 万条 RNA 的过往化学探针数据上训练而来——能相当准地"模拟"出 SHAPE 信号，提前预判一个设计会得几分。

RNet预测与实验OpenKnot分数的相关性 — 图 S4RNet 模拟分数（B）与实验 OpenKnot 分数高度相关（Pearson r = 0.79），明显优于仅看 RNet-SS 二级结构 F1（A，r = 0.56）——这意味着 RNet 可以在实验之前就帮设计者"预筛"。

于是第二轮，人类玩家在界面里用上了 RNet，AI 方法（gRNAde、MPNN-fixbb、MPNN-RFdiff，以及新加入的 codesign-RFdiff）也接入了 RNet。

第一轮与第二轮的Z-score热图 — 图 S5基于 Z-score 的独立评估同样显示：从第一轮（A）到第二轮（B），AI 方法的成绩显著上移，与 Eterna 玩家的差距被迅速抹平。

第一轮与第二轮成功率柱状图 — 图 1H/J成功率（OpenKnot 分数 > 90 的目标比例）对比。第二轮中，所有 AI 方法和 Eterna 玩家在自己提交设计的目标里都有 80% 以上达标，方法之间已无统计学显著差异——**AI 追平了人类。**

叁真正的考验：能不能泛化到全新结构

第二轮的"追平"，可能只是因为大家在同一批 17 个目标上反复打磨。会不会只是过拟合？

于是有了第三、第四轮——全新的 40 个假结目标，而且故意减少了来自 PDB 已知三维结构的比例（避免 AI 靠"背训练集"作弊），长度还一路拉到 240 个核苷酸。

Figure 2：40个新假结目标上的表现 — 图 240 个新假结目标上的表现。（A-B）Round 3 代表目标 P20（Kissing Multiloops）与 P16；（C）Round 3 整体成功率；（D-E）Round 4 长序列目标 Q08（Rous 肉瘤病毒）与 Q20；（F）Round 4 整体成功率。长序列上，AI 方法对天然起始序列形成大幅碾压。

成绩单：第三轮 20 个目标，AI 和人类合起来 19/20 达到 OpenKnot 分数 90；第四轮（长序列）同样 19/20。唯一一个谁都搞不定的目标是 P16（"AK_PK100-3"）。

第四轮的长序列尤其能说明问题——天然起始序列在 20 个目标里只成功了 4 个，而 AI 方法每一种都大幅碾压了起始序列。不再需要反复迭代精修，AI 一把就能设计出天然和非天然的假结。

肆再用补偿突变把每根茎都验一遍

SHAPE 信号准，不代表碱基配对就一定对。有没有可能某些核苷酸被"保护"住了，但其实形成了别的配对，只是恰好骗过了 SHAPE？

为了堵这个漏洞，研究者上了第二套独立手段——补偿突变（mutate-map-rescue，M2R-seq）。逻辑很漂亮：如果两个核苷酸真的配对，单独突变其一会破坏结构、让 SHAPE 信号在突变点附近乱掉；但如果把这对碱基同时翻转（比如 C-G 换成 G-C），配对恢复，SHAPE 信号也该跟着"复活"。

Figure 3：补偿突变验证碱基对 — 图 3补偿突变（M2R-seq）逐对验证碱基配对。（B-C）单突变 G38C、C61G 造成局部 SHAPE 扰动；（D）双突变恢复 38-61 配对，信号"复活"；（F）该设计所有目标碱基对的 rescue factor 矩阵；（G）各方法在 20 个 Round 3 目标上验证 ≥80% 茎形成的成功率。

结果：17/20 的目标，至少有一个设计实现了 100% 的目标茎恢复；19/20 的目标，至少有一个设计恢复率超过 80%。补偿突变给出的结论，和 SHAPE 分数完全一致——AI 和资深人类设计师一样，能稳定、精准地设计复杂假结的二级结构。

伍冷冻电镜看到了"没设计过"的东西

二级结构对了，三维到底长什么样？研究者挑了 Eterna 玩家提出的"Kissing Multiloops"（目标 P20）做冷冻电镜，并把设计嵌进一个环状重排的 II 类内含子骨架里，以提升可见性、打破赝对称。

八个设计里，四个在纯化时就聚集或解折叠了——巧的是，这四个恰好都是补偿突变恢复率低于 80% 的。剩下来自 Struct2SeQ-SHAPE、MPNN-fixbb、gRNAde 的三个设计成功成像，锐化后分辨率分别到 4.8 Å、4.0 Å、2.9 Å。

Figure 4：AI设计假结的冷冻电镜结构 — 图 4AI 设计假结的冷冻电镜结构。（A）Kissing Multiloops 目标二级结构；（B）AlphaFold 3 预测模型；（C-E）三个 AI 设计的冷冻电镜密度图与拟合坐标——全部 7 根茎精准重现（碱基对 F1 高达 0.89/0.95/0.95），但折叠拓扑与 AF3 预测明显不同，插图中可见额外的非经典相互作用。

真正的震撼在这里：研究者用对序列完全不知情的"盲建模"去搭坐标，结果三个设计都精准形成了目标里全部 7 根茎。但——这三个折叠，跟任何已知 RNA 结构都不同源，也跟 AlphaFold 3 的预测对不上。

论文正文：三个折叠不同源、与AF3不匹配 — 原文三个折叠均与既往 RNA 结构不同源，也不匹配 AlphaFold 3 模型；高分辨率设计中还出现了额外的非经典碱基对、碱基三联体与三级相互作用——而这些并未被 AI 显式设计。

更关键的是，在分辨率最高的两个设计里，研究者看到了额外的非经典碱基对、碱基三联体、三级相互作用——而这些，AI 在设计时根本没有显式地考虑过。AI 只盯着二级结构去设计，结果分子自己"长"出了一套精巧的三维细节。这些非经典相互作用，正是天然 RNA 实现复杂功能的关键。

尾声写在最后

蛋白质设计的故事，大家已经听了好几年：结构预测先行，设计随后。

RNA 这次走了一条完全不同的路——没有等三维预测的"裁判"到位，而是用海量化学探针数据训出一个二级结构的"裁判"，直接开打。

结果是，AI 不光追平了那些在 Eterna 上磨了十几年的人类高手，还造出了自然界里从不存在、连 AlphaFold 3 都没见过的 RNA 折叠。

RNA 设计这道墙，可能比所有人以为的都要早倒下。

Reference De novo design of RNA pseudoknots with deep learning. Townley J, Kladwang W, Baker D, et al. bioRxiv (2026). DOI: 10.64898/2026.05.21.726960. 通讯作者：Rhiju Das（Stanford University School of Medicine / HHMI）。

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